CELULAS MADRE - 干细胞 - STEM CELLS

CELULAS MADRE EN ESPAÑA ¿PORQUÉ NO SE AUTORIZAN?

Las células madre derivadas de la orina, conocidas como USCs (Urine-derived Stem Cells), son una forma prometedora, no invasiva y accesible de células madre humanas que se pueden obtener directamente de la orina frescade adultos sanos o enfermos.

¿QUÉ SON LAS USCs?

Las USCsson células madre multipotentes que se pueden aislar de la orina espontáneamente eliminada por el organismo. Fueron descubiertas en humanos por investigadores chinos y alemanes a principios de la década de 2000.

Procedencia:

• Se cree que provienen del epitelio del tracto urinario, como:
  • Túbulos renales
  • Uréter
  • Vejiga

    

PROPIEDADES DESTACADAS

Propiedad                                         Descripción

Multipotencia               Se diferencian en hueso, grasa, cartílago, músculo, neuronas, etc.

Bajo riesgo inmunológico   Especialmente   si son autólogas (del mismo paciente)

Fácil   obtención                   Solo   requiere orina fresca (50–200 ml)

Cultivo   sencillo                  Crecen en   medios similares a MSCs (células mesenquimales)

Marcadores   específicos    CD44+,   CD73+, CD90+, CD105+, CD45-, CD34-

Capacidad   regenerativa     En piel,   músculo, vejiga, riñón, cerebro, etc.

¿CÓMO SE OBTIENEN?

1. Recolectar orina estéril (idealmente por la mañana)
2. Centrifugar a 400–500 g para concentrar las células
3. Cultivar en medio DMEM/F12 + suero fetal bovino
4. A los 5–7 días comienzan a crecer colonias
5. En 2–3 semanas, se alcanzan niveles útiles para estudios o terapias

POSIBLES APLICACIONES MÉDICAS

Área médica                       Aplicación de USCs o sus exosomas

Geriatría                             Envejecimiento cerebral, fragilidad

Neurología                         Alzheimer, Parkinson, ictus (plasticidad cerebral)

Urología                              Incontinencia urinaria de esfuerzo femenina

Nefrología                           Enfermedad renal crónica, reparación de nefronas

Dermatología                     Cicatrización,rejuvenecimiento, quemaduras

Psiquiatría                          Depresión,   ansiedad, autismo (en fase experimental)

LIMITACIONES Y CUIDADOS

• Aún no aprobadas como terapia clínica estándar      en Europa o EE. UU.
• Su uso requiere laboratorios GMP certificados si se busca aplicación en humanos.
• Ensayos clínicos en curso, especialmente en Asia (China,Corea del Sur)
• No deben confundirse con productos fraudulentos de “células madre” en clínicas sin regulación

ESTUDIOS DESTACADOS

• Zhou et al. (2006–2012): Primer aislamiento de USCs      humanas con diferenciación ósea, muscular y nerviosa
• Zhang et al. (2017, Stem      Cell Research & Therapy): Regeneración de vejiga y esfínter urinario en      modelos animales
• Li et al. (2022, Aging Cell): Exosomas de USCs mejoran      memoria y neurogénesis en ratones envejecidos

VENTAJAS FRENTE A OTRAS CÉLULAS MADRE

Comparación                      USCs                  Células madre de médula ósea

Obtención                   No   invasiva (orina)     Invasiva   (aspiración de hueso)

Tolerancia inmune      Alta   (autólogas)          Alta

Facilidad   de cultivo   Alta                              Media

Aplicaciones               Muy   diversas              Osteohematológicas   y algunas otras

EN RESUMEN

• Seguras y accesibles
• Versátiles y regenerativas
• Ideales para medicina personalizada y antienvejecimiento
• No aprobadas aún como tratamiento estándar

西班牙的干细胞：为何未获授权？

尿源干细胞（USC）是一种前景广阔、非侵入性且易于获取的人体干细胞，可直接从健康或患病成人的新鲜尿液中获取。

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什么是USC？

USC是多能干细胞，可以从人体自然排出的尿液中分离出来。它们是由中国和德国的研究人员于21世纪初在人体中发现的。

来源：

• 它们被认为起源于泌尿道上皮，例如：

o 肾小管

o 输尿管

o 膀胱

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突出特性                         特性描述

多能。               它们可分化成骨骼、脂肪、软骨、肌肉、神经元等。

免疫风险低，    尤其当其为自体来源（来自同一患者）时。

易于获取。        仅需新鲜尿液（50-200 毫升）。

培养简单。        可在与 MSC（间充质干细胞）类似的培养基中生长。

特异性标记：    CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD45-、CD34-

具有再生能力。 可用于皮肤、肌肉、膀胱、肾脏、脑等组织。

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如何获取？

1. 收集无菌尿液（最好在早晨）

2. 400-500 g 离心浓缩细胞

3. 在 DMEM/F12 培养基 + 胎牛血清中培养

4. 5-7 天后菌落开始生长

5. 2-3 周内达到可用于研究或治疗的水平

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可能的医疗应用

医疗领域 : USC 或其外泌体的医疗领域应用

老年病学：脑老化、脆弱性

神经病学：阿尔茨海默病、帕金森病、中风（脑可塑性）

泌尿科：女性压力性尿失禁

肾脏病学：慢性肾病、肾单位修复

皮肤病学：康复、复原、烧伤

精神病学：抑郁症、焦虑症、自闭症（实验性）

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局限性和注意事项

• 尚未在欧洲获批作为标准临床疗法或美国

• 如果用于人体，则需要获得 GMP 认证的实验室。

• 临床试验正在进行中，尤其是在亚洲（中国、韩国）

• 不应与不受监管的诊所中销售的欺诈性“干细胞”产品混淆

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重点研究

• Zhou 等人（2006-2012 年）：首次分离出具有骨、肌肉和神经分化能力的人类原发性干细胞

• Zhang 等人（2017 年，《干细胞研究与治疗》）：动物模型中的膀胱和尿道括约肌再生

• Li 等人(2022, Aging Cell): 原代干细胞外泌体改善老年小鼠记忆力和神经发生

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优于其他干细胞的优势

比较               USCs                         骨髓干细胞

获取方式：   非侵入性（尿液）      侵入性（骨穿刺）

免疫耐受性：高（自体）                高

培养难度：    高                              中

应用：           应用范围广泛：        骨血液学及其他

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总结

• 安全便捷

• 用途广泛，具有再生能力

• 是个性化医疗和抗衰老的理想选择

• 尚未获批作为标准疗法

STEM CELLS IN SPAIN: WHY ARE THEY NOT AUTHORIZED?

Urine-derived stem cells, known as USCs, are a promising, non-invasive, and accessible form of human stem cells that can be obtained directly from the fresh urine of healthy or diseased adults.

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WHAT ARE USCs?

USCs are multipotent stem cells that can be isolated from the urine spontaneously excreted by the body. They were discovered in humans by Chinese and German researchers in the early 2000s.

Origin:

• They are believed to originate from the epithelium of the urinary tract, such as:

o Renal tubules

o Ureter

o Bladder

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HIGHLIGHTED PROPERTIES

Property                             Description

Multipotent.                      They differentiate into bone, fat, cartilage, muscle, neurons, etc.

Low immunological risk,   Especially if autologous (from the same patient).

Easy to obtain.                 Only requires fresh urine (50–200 ml).

Simple culture.                 Grows in media similar to MSCs (mesenchymal stem cells).

Specific markers:              CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, CD45-, CD34-

Regenerative capacity.     In skin, muscle, bladder, kidney, brain, etc.

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HOW ARE THEY OBTAINED?

1. Collect sterile urine (ideally in the morning)

2. Centrifuge at 400–500 g to concentrate the cells

3. Culture in DMEM/F12 medium + fetal bovine serum

4. Colonies begin to grow after 5–7 days

5. Within 2–3 weeks, useful levels for studies or therapies are reached

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POSSIBLE MEDICAL APPLICATIONS

Medical area                 Application of USCs or their exosomes

Geriatrics                      Brain aging, fragility

Neurology                     Alzheimer's, Parkinson's, stroke (brain plasticity)

Urology                         Female stress urinary incontinence

Nephrology                   Chronic kidney disease, nephron repair

Dermatology                 Healing, rejuvenation, burns

Psychiatry                     Depression, anxiety, autism (experimental)

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LIMITATIONS AND CAUTIONS

• Not yet approved as standard clinical therapy in Europe or the US

• Its Use requires GMP-certified laboratories if human application is sought.

• Clinical trials are ongoing, especially in Asia (China, South Korea)

• Should not be confused with fraudulent “stem cell” products in unregulated clinics

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HIGHLIGHTED STUDIES

• Zhou et al. (2006–2012): First isolation of human USCs with bone, muscle, and nerve differentiation

• Zhang et al. (2017, Stem Cell Research & Therapy): Bladder and urinary sphincter regeneration in animal models

• Li et al. (2022, Aging Cell): Exosomes from USCs improve memory and neurogenesis in aged mice

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ADVANTAGES OVER OTHER STEM CELLS

Comparison              of USCs                                     with bone marrow stem cells

Obtention:                 Non-invasive (urine)                  Invasive (bone aspiration)

Immune tolerance:    High (autologous)                     High

Ease of culture:         High                                          Medium

Applications:              Wide range of applications:      Osteohematology and some others

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IN SUMMARY

• Safe and accessible

• Versatile and regenerative

• Ideal for personalized medicine and anti-aging

• Not yet approved as standard treatment

PROTOCOLO PARA OBTENER CÉLULAS MADRE DERIVADAS DE ORINA (USCs)

MATERIALES NECESARIOS

Tipo                                 Elemento específico

 Biológico                       Orina   fresca estéril (50–200 ml)

 Equipos                         Centrífuga   (capaz de 400–500 g)(mas de 2000 rpm)

                                         Incubadora   (37 °C, 5% CO₂)

                                        Cabina de   bioseguridad (tipo II)

                                        Microscopio   invertido

 Cultivo                           Frascos   T25 o placas de 6–12 pocillos

                                        Pipetas y   puntas estériles

                                       Tubos   Falcon 50 ml

 Medios y reactivos       Medio   DMEM/F12 (1:1)

                                        10% Suero   fetal bovino (FBS, filtrado)

                                        1%   Penicilina/Estreptomicina

                                         1%   L-Glutamina

                                         PBS   (solución salina tamponada)

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

En un frasco estéril, mezclar:

• 90 ml DMEM/F12 (1:1)
• 10 ml FBS (calentado a 37 °C y      filtrado)
• 1 ml Penicilina/E.
• 1 ml L-Glutamina

Filtrar el medio preparado (0.22 μm) y guardar a 4 °C.

PROCEDIMIENTO PASO A PASO

1. Recolección de la orina

• Recolecta 50–200 ml de orina estéril, idealmente de la primera micción del día.
• Procesar la orina en las primeras 2 horas tras la recolección.

2. Centrifugación

• Centrifuga la muestra a 400–500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.(2.000 rpm o más)
• Elimina cuidadosamente el sobrenadante, dejando el pellet celular en el fondo.

3. Lavado

• Añade 10 ml de PBS estéril al pellet, resuspende suavemente.
• Centrifuga de nuevo a 400 g por10 minutos.
• Retira el sobrenadante.

4. Siembra celular

• Resuspende el pellet en 1–2 ml de medio de cultivo.
• Siembra en un frasco T25 o en una placa de 6 pocillos.
• Incuba a 37 °C, 5% CO₂, en humedad controlada.

5. Cambio de medio

• A las 24 h, cambia el medio para eliminar células no adherentes.
• Luego cambia el medio cada 2–3 días.

6. Seguimiento

• Las colonias de USCs comenzarán a aparecer entre 5 y 10 días.
• Al alcanzar 70–80% de confluencia, realiza el primer subcultivo (pasaje 1).

7. Subcultivo (pasaje)

• Lava con PBS, luego usa trypsina 0.05% por 3–5 min para desprender células.
• Resuspende en nuevo medio y siembra en frasco limpio (T75 o T25).
• Las USCs se pueden pasar hasta pasaje 5–7 antes de perder potencia.
• 
  

VERIFICACIÓN DE IDENTIDAD CELULAR

Por citometría de flujo (opcional):

Marcadores positivos              CD44+, CD73+, CD90+, CD105+

Marcadores   negativos              CD34-,   CD45-

Por diferenciación (opcional):

• En medios específicos, pueden diferenciarse a:
  • Osteoblastos (hueso)
  • Adipocitos (grasa)
  • Condrocitos (cartílago)

· Usa 0.05% tripsina-EDTA, incubando 3–5 minutos a 37 °C.

· Cuando las células se redondean y se desprenden, neutraliza inmediatamente con medio completo (que contiene FBS).

Es fundamental eliminar completamente el suero fetal bovino (FBS) y la tripsina para evitar reacciones adversas.

· Centrifuga a 400 g durante 5 minutos.

· Descarta el sobrenadante (contiene tripsina y FBS).

· Lava con PBS estéril sin Ca²⁺/Mg²⁺.

· Centrifuga y repite el lavado al menos 2 veces.

El vehículo debe ser:

· Estéril

· Apirógeno

· Compatible con infusión intravenosa humana

· No tóxico para las células

PBS estéril (sin Ca²⁺/Mg²⁺) o
Solución salina fisiológica (NaCl 0.9%) estéril para inyección

Muchos protocolos usan también Plasmalyte A o Ringer Lactato, pero PBS y NaCl 0.9% son los más comunes y fácilmente accesibles.

· Recuento celular (opcional, pero recomendable).

· Resuspende las USCs en el vehículo elegido, a una concentración final de:

  1–10 millones de células/ml

· Mantén la suspensión en frío (4 °C) si la vas a usar en menos de 2 horas.

· Inyectar lentamente en vena o mediante infusión (según el protocolo clínico/experimental).

Aspecto                                                                 Recomendación

Vía de administración                                            IV (vena periférica o cola en animales)

Tiempo máximo entre preparación e inyección     ≤2 horas

Vehículo compatible                                              PBS o NaCl 0.9% estéril

Lo que debes evitar                                               FBS, antibióticos, restos de tripsina

Opcional                                                                 Filtrar por malla estéril 40 μm para 

                                                                               evitar agregados.                                    

尿源性干细胞 (USC) 获取方案

所需材料

类型                        特定元素

生物材料：             新鲜无菌尿液 (50-200 ml)

设备：                    离心机（400-500 g）

                               培养箱（37°C，5% CO₂）

                               生物安全柜（II 型）

                               倒置显微镜

培养物：                T25 培养瓶或 6-12 孔板

                              无菌移液器和吸头

                              50 ml Falcon 管

培养基和试剂：     DMEM/F12 培养基 (1:1)

                              10% 胎牛血清（FBS，过滤）

                              1% 青霉素/链霉素

                              1% L-谷氨酰胺

                              PBS（缓冲盐水）

培养基制备

在无菌培养瓶中混合：

                                    • 90 ml DMEM/F12 (1:1)

                                    • 10 ml FBS（预热至 37°C 并过滤）

                                    • 1 ml 青霉素/E

                                    • 1 ml L-谷氨酰胺

将配制好的培养基过滤 (0.22 μm)，并储存于 4°C。

步骤说明

1. 尿液收集

                     • 收集 50-200 ml 无菌尿液，最好收集当天第一次排尿。

                     • 收集尿液后 2 小时内处理。

2. 离心

                    • 室温下以 400-500 g 离心样品 10 分钟（2,000 rpm 或更高）。

                    • 小心去除上清液，使细胞沉淀留在底部。

3. 洗涤

                    • 向沉淀中加入 10 ml 无菌 PBS，轻轻重悬。

                    • 再次以 400 g 离心 10 分钟。

                    • 弃上清液。

4. 细胞接种

                    • 将细胞沉淀重悬于 1-2 ml 培养基中。

                    • 接种于 T25 培养瓶或 6 孔板中。

                    • 在 37°C、5% CO₂ 和湿度控制的条件下培养。

5. 更换培养基

                    • 24 小时后更换培养基以去除未贴壁的细胞。

                    • 之后每 2-3 天更换一次培养基。

6. 监测

                    • USC 菌落将在 5 至 10 天内开始出现。

                    • 达到 70-80% 汇合度后，进行第一次传代培养（第 1 代）。

7. 传代培养（第 1 代）

                    • 用 PBS 清洗，然后用 0.05% 胰蛋白酶消化 3-5 分钟以分离细胞。

                    • 用新鲜培养基重悬，并接种于干净的培养瓶（T75 或 T25）。

                    • USCs 可传代至 5-7 代，直至失效。

细胞身份验证

流式细胞术（可选）：

阳性标记：   CD44+、CD73+、CD90+、CD105+

阴性标记：   CD34-、CD45-

分化（可选）：

• 在特定培养基中，可分化为：

                     o 成骨细胞（骨）

                     o 脂肪细胞（脂肪）

                     o 软骨细胞（软骨）

静脉注射 USCs 的制备步骤

1. 用胰蛋白酶分离（如上所述）

• 使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，在 37°C 下孵育 3-5 分钟。

• 当细胞变圆并脱落时，立即用完全培养基（含胎牛血清）中和。

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2. 细胞清洗

⚠必须彻底去除胎牛血清 (FBS) 和胰蛋白酶，以避免不良反应。

• 400 g 离心 5 分钟。

• 弃去上清液（含胰蛋白酶和 FBS）。

• 用不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的无菌 PBS 清洗。

• 离心并重复清洗至少两次。

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3. 注射用重悬液

重要提示：

载体必须：

• 无菌

• 无热原

• 适用于人体静脉输注

• 对细胞无毒

安全标准选项：

无菌PBS（无Ca²⁺/Mg²⁺）或

注射用无菌生理盐水（0.9% NaCl）

许多方案也使用Plasmalyte A或乳酸林格氏液，但PBS和0.9% NaCl是最常见且易获得的。

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如何重悬？

• 细胞计数（可选，但建议）。

• 将CSU重悬于所选载体中，最终浓度为：

o 1-10百万个细胞/毫升

• 如果您将在2小时内使用悬浮液，请将其冷藏（4°C）。

• 缓慢静脉注射或输注（根据临床/实验方案）。

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关键考虑因素

方面建议

给药途径：                                          静脉注射（动物外周静脉或尾部注射）

准备和注射之间的最大间隔时间：     ≤2 小时

适用载体：                                          PBS 或 0.9% 无菌氯化钠

避免接触：                                          胎牛血清 (FBS)、抗生素和胰蛋白酶残留

可选：                                                 通过 40 μm 无菌滤网过滤，以避免聚集

PROTOCOL FOR OBTAINING URINARY-DERIVED STEM CELLS (USCs)

NECESSARY MATERIALS

Type                              Specific Element

Biological:                Fresh sterile urine (50–200 ml)

Equipment:              Centrifuge (capable of 400–500 g)

                                Incubator (37°C, 5% CO₂)

                                Biosafety cabinet    (type II)

                                Inverted microscope

Culture:                   T25 flasks or 6–12-well plates

                                Sterile pipettes and tips

                                50 ml Falcon tubes

Media and reagents:     DMEM/F12 medium (1:1)

                                      10% Fetal bovine serum (FBS, filtered)

                                      1% Penicillin/Streptomycin

                                      1% L-Glutamine

                                       PBS (buffered saline)

CULTURE MEDIUM PREPARATION

In a sterile flask, mix:

                                   • 90 ml DMEM/F12 (1:1)

                                   • 10 ml FBS (warmed to 37°C and filtered)

                                   • 1 ml Penicillin/E

                                   • 1 ml L-Glutamine

Filter the prepared medium (0.22 μm) and store at 4°C.

STEP-BY-STEP PROCEDURE

1. Urine Collection

• Collect 50–200 ml of sterile urine, ideally from the first urination of the day.

• Process urine within the first 2 hours of collection.

2. Centrifugation

• Centrifuge the sample at 400–500 g for 10 minutes at room temperature (2,000 rpm or more).

• Carefully remove the supernatant, leaving the cell pellet at the bottom.

3. Washing

• Add 10 ml of sterile PBS to the pellet and resuspend gently.

• Centrifuge again at 400 g for 10 minutes.

• Remove the supernatant.

4. Cell Seeding

• Resuspend the pellet in 1–2 ml of culture medium.

• Seed in a T25 flask or 6-well plate.

• Incubate at 37°C, 5% CO₂, with controlled humidity.

5. Medium Change

• After 24 h, change the medium to remove non-adherent cells.

• Then change the medium every 2–3 days.

6. Monitoring

• Colonies of USCs will begin to appear between 5 and 10 days.

• Upon reaching 70–80% confluence, perform the first subculture (passage 1).

7. Subculture (Passage)

• Wash with PBS, then use 0.05% trypsin for 3–5 min to detach cells.

• Resuspend in fresh medium and seed in a clean flask (T75 or T25).

• USCs can be passaged up to passages 5–7 before losing potency.

CELL IDENTITY VERIFICATION

By flow cytometry (optional):

Positive markers: CD44+, CD73+, CD90+, CD105+

Negative markers: CD34-, CD45-

By differentiation (optional):

• In specific media, they can differentiate into:

o Osteoblasts (bone)

o Adipocytes (fat)

o Chondrocytes (cartilage)

STEPS TO PREPARE USCs FOR INTRAVENOUS INJECTION

1. Detachment with trypsin (as already done)

• Use 0.05% trypsin-EDTA, incubating for 3–5 minutes at 37°C.

• When cells round up and detach, neutralize immediately with complete medium (containing FBS).

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2. Cell Washing

⚠It is essential to completely remove fetal bovine serum (FBS) and trypsin to avoid adverse reactions.

• Centrifuge at 400 g for 5 minutes.

• Discard the supernatant (containing trypsin and FBS).

• Wash with sterile PBS without Ca²⁺/Mg²⁺.

• Centrifuge and repeat the wash at least twice.

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3. Resuspension for Injection

IMPORTANT:

The vehicle must be:

• Sterile

• Non-pyrogenic

• Compatible with human intravenous infusion

• Non-toxic to cells

SAFE AND STANDARD OPTION:

Sterile PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free) or

Sterile physiological saline (0.9% NaCl) for injection

Many protocols also use Plasmalyte A or Lactated Ringer's, but PBS and 0.9% NaCl are the most common and readily available.

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How to resuspend them?

• Cell count (optional, but recommended).

• Resuspend the CSUs in the chosen vehicle, to a final concentration of:

o 1–10 million cells/ml

• Keep the suspension refrigerated (4°C) if you will use it within 2 hours.

• Inject slowly into a vein or by infusion (according to the clinical/experimental protocol).

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CRITICAL CONSIDERATIONS

Aspect Recommendation

Route of administration: IV (peripheral vein or tail in animals)

Maximum time between preparation and injection: ≤2 hours

Compatible vehicle: PBS or 0.9% sterile NaCl

What to avoid: FBS, antibiotics, and trypsin residue

Optional: Filter through a sterile 40 μm mesh to avoid aggregates